Kultur Jaringan Media-Komposisi
MEDIA KOMPONEN
Salah satu faktor yang paling penting yang mengatur pertumbuhan dan morfogenesis dari kultur jaringan adalah komposisi media. Persyaratan dasar gizi sel tanaman kultur jaringan sangat mirip dengan tanaman pada umumnya.
Media Kultur jaringan umumnya terdiri dari beberapa komponen berikut diantaranya: macronutrients, mikronutrien, vitamin, asam amino atau suplemen nitrogen lainnya, gula (s), suplemen organik lainnya terdefinisi. Beberapa formula media biasanya digunakan untuk sebagian besar dari semua sel dalam kultur jaringan. Formulasi media ini termasuk yang dijelaskan oleh White, Murashige dan Skoog, gamborg et. al., Schenk dan Hilderbrandt, Nitsch dan Nitsch, dan Lloyd dan McCown. Murashige dan Skoog's medium MS, Schenk dan Hildebrand's menengah SH, dan gamborg's B-5 menengah semua tinggi di macronutrients, sedangkan media lainnya formulasi mengandung lebih sedikit dari macronutrients.
Macronutrients
macronutrients menyediakan enam besar elemen-nitrogen (N), fosfor (P), kalium (K), kalsium (Ca), magnesium (Mg), dan sulfur (S)-yang diperlukan untuk pertumbuhan sel tanaman atau jaringan. Konsentrasi optimum masing-masing gizi untuk mencapai tingkat pertumbuhan maksimum bervariasi antar spesies.
Media kultur jaringan harus mengandung setidaknya 25-60 mM nitrogen anorganik untuk pertumbuhan sel tumbuhan yang memadai. Sel tanaman dapat tumbuh pada nitrat saja, tapi hasil jauh lebih baik diperoleh jika mengandung ammonium nitrat dan sumber nitrogen. jenis tertentu memerlukan amonium atau sumber lain nitrogen dikurangi untuk pertumbuhan sel terjadi. Nitrat biasanya disertakan dalam kisaran 25-20 mM; konsentrasi amonium tipikal berkisar antara 2 dan 20 mM. Namun, konsentrasi amonium lebih dari 8 mM dapat merugikan bagi pertumbuhan sel spesies tertentu. Sel dapat tumbuh pada medium yang mengandung ammonium sebagai sumber nitrogen tunggal jika satu atau lebih asam siklus TCA (misalnya, sitrat, suksinat, atau malat) juga termasuk dalam medium pada konsentrasi sekitar 10 mM. Ketika ammonium nitrat dan sumber nitrogen yang digunakan bersama-sama di dalam media kultur, ion ammonium akan digunakan bersama-sama di dalam media kultur, ion ammonium akan dimanfaatkan dengan lebih cepat dan sebelum ion nitrat.
Kalium diperlukan untuk pertumbuhan sel dari jenis tumbuhan yang paling. Kebanyakan media mengandung K, dalam bentuk nitrat atau klorida, pada konsentrasi 2-30 mM. Optimum konsentrasi P, Mg, S, dan kisaran 1-3 mM Ca ketika semua persyaratan lainnya untuk pertumbuhan sel puas. konsentrasi yang lebih tinggi gizi ini mungkin diperlukan jika kekurangan dalam nutrisi lain ada.
Mikronutrien
The mikronutrien penting untuk sel tumbuhan dan pertumbuhan jaringan termasuk besi (Fe), mangan (Mn), seng (Zn), boron (B), tembaga (Cu), dan molibdenum (Mo). Chelated bentuk besi dan seng yang umum digunakan dalam mempersiapkan media kultur. Besi mungkin yang paling penting dari semua mikro. Besi sitrat dan tartrat dapat digunakan dalam media kultur, tetapi senyawa ini sulit untuk membubarkan dan sering presipitat setelah media disiapkan. Murashige dan Skoog digunakan etilen asam diaminetetraacetic (EDTA)-chelate besi untuk memotong masalah ini.
Kobalt (Co) dan yodium (I) juga dapat ditambahkan ke media tertentu, namun persyaratan ketat pertumbuhan sel untuk elemen ini belum ditetapkan. Natrium (Na) dan klorin (Cl) juga digunakan di beberapa media, namun tidak penting untuk pertumbuhan sel. Cobalt tembaga dan biasanya ditambahkan ke media kultur pada konsentrasi 0,1 µM, Fe dan Mo pada 1 µM, aku di 5 µM, Zn pada 50-30 µM, pada 20-90 µM Mn, dan B di 25-100 µM.
Karbon dan Sumber Energi
Karbohidrat pilihan dalam media kultur sel tanaman adalah sukrosa. Glukosa dan fruktosa bisa diganti dalam beberapa kasus, glukosa yang sama efektifnya dengan sukrosa dan fruktosa yang agak kurang efektif. karbohidrat lain yang telah diuji termasuk laktosa, galaktosa, rafinose, maltosa, dan pati. konsentrasi sukrosa media budaya biasanya berkisar antara 2 dan 3 persen. Penggunaan fruktosa diautoklaf dapat merugikan pertumbuhan sel.
Karbohidrat harus diberikan ke dalam media kultur karena beberapa baris sel tumbuhan telah diisolasi yang sepenuhnya autotropic, misalnya, mampu memasok kebutuhan mereka sendiri karbohidrat oleh asimilasi CO2 selama fotosintesis.
Vitamin
Normal tanaman mensintesis vitamin yang diperlukan untuk pertumbuhan dan pembangunan. Vitamin diperlukan oleh tanaman sebagai katalis dalam proses metabolisme. Ketika sel-sel dan jaringan tanaman tumbuh in vitro, beberapa vitamin dapat menjadi faktor pembatas untuk pertumbuhan sel. Vitamin yang paling sering digunakan di sel dan media kultur jaringan meliputi thiamin (B1), nicotinic acid, pyridoxine (B6), dan myo-inositol. Tiamin adalah vitamin yang pada dasarnya dibutuhkan oleh semua sel untuk pertumbuhan. Thiamin biasanya digunakan pada konsentrasi berkisar 0,1-10,0 mg / liter. Nicotinic acid dan pyridoxine sering ditambahkan ke media kultur tetapi tidak penting bagi pertumbuhan sel dalam banyak spesies. Asam nikotinat biasanya digunakan pada konsentrasi 0,1-5,0 mg / liter; pyridoxine digunakan di 0,1-10,0 mg / liter.
Myo-inositol umumnya termasuk dalam solusi stok banyak vitamin. Meskipun adalah karbohidrat tidak vitamin, itu telah ditunjukkan untuk merangsang pertumbuhan sel dalam budaya tertentu. Keberadaannya dalam medium tidak penting, tetapi dalam jumlah kecil-myo inositol merangsang pertumbuhan sel di sebagian besar spesies. Myo-inositol umumnya digunakan dalam sel tumbuhan dan media kultur jaringan pada konsentrasi 5-50 mg / liter.
vitamin lain seperti biotin, asam folat, asam askorbat, asam pantotenat, vitamin E (tokoferol), riboflavin, dan asam p-aminobenzoic telah dimasukkan dalam beberapa media kultur sel. Persyaratan untuk vitamin ini dengan kultur jaringan tanaman umumnya diabaikan, dan mereka tidak dianggap membatasi pertumbuhan-faktor. Vitamin ini biasanya ditambahkan ke medium kultur hanya ketika ada konsentrasi thiamin adalah di bawah tingkat yang diinginkan atau bila diinginkan untuk tumbuh sel pada kepadatan populasi yang sangat rendah.
Asam amino atau Nitrogen Lain Suplemen
Meskipun sel dikultur biasanya mampu mensintesis semua asam amino yang dibutuhkan, penambahan asam amino tertentu atau campuran asam amino dapat digunakan untuk lebih merangsang pertumbuhan sel. Penggunaan asam amino sangat penting untuk membangun kultur sel dan kultur protoplas. asam amino menyediakan sel-sel tumbuhan dengan segera tersedia sumber nitrogen, yang secara umum dapat diambil oleh sel-sel lebih cepat dari nitrogen anorganik.
Sumber-sumber yang paling umum nitrogen organik digunakan dalam media kultur adalah campuran asam amino (misalnya, hidrolisat kasein), L-glutamin, L-Asparagina, dan adenin. Kasein hidrolisat umumnya digunakan pada konsentrasi antara 0,05 dan 0,1 persen. Ketika asam amino ditambahkan sendiri, harus berhati-hati, karena mereka dapat menghambat pertumbuhan sel. Contoh asam amino termasuk dalam media kultur untuk meningkatkan pertumbuhan sel glisin sebesar 2 mg / liter, glutamin hingga 8 mM, Asparagina pada 100 mg / liter, L-arginin dan sistein pada 10 mg / liter, dan L-tirosin pada 100 mg / liter. Tirosin telah digunakan untuk merangsang morfogenesis dalam budaya sel tetapi hanya harus digunakan dalam media agar. Suplementasi dari medium dengan adenin sulfat dapat merangsang pertumbuhan sel dan sangat meningkatkan pembentukan tunas.
Undefined Suplemen Organik
Penambahan berbagai ekstrak organik untuk media kultur sering menghasilkan respon jaringan yang menguntungkan. Suplemen yang telah diuji mencakup hydrolysates protein, santan ekstrak ragi, ekstrak malt, pisang tanah, jus jeruk, dan jus tomat. Namun, suplemen organik tidak terdefinisi seharusnya hanya digunakan sebagai upaya terakhir, dan hanya santan dan hydrolysates protein digunakan sampai batas tertentu hari ini. Protein (kasein) hydrolysates umumnya ditambahkan ke dalam media kultur pada konsentrasi 0,05-0,1%, sedangkan air kelapa umumnya digunakan pada 5-20% (v / v).
Penambahan arang aktif (AC) untuk media kultur dapat memiliki efek menguntungkan. Pengaruh AC umumnya dikaitkan dengan salah satu dari tiga faktor: penyerapan senyawa hambat, penyerapan zat pengatur tumbuh dari medium, atau penggelapan medium. Penghambatan pertumbuhan di hadapan AC umumnya dikaitkan dengan penyerapan phytohormones ke AC. 1-Napthaleneacetic asam (AAN), kinetin, 6-benzilamino (BA), indole-3-asam asetat (IAA), dan 6-?-?-dimethylallylaminopurine (2ip) semua mengikat untuk AC, dengan dua pengatur tumbuh yang terakhir mengikat cukup cepat. Stimulasi pertumbuhan sel oleh AC umumnya dikaitkan dengan kemampuannya untuk mengikat senyawa fenolik beracun yang dihasilkan selama budaya. Diaktifkan arang umumnya asam-dicuci sebelum Selain medium pada konsentrasi 0,5-3,0 persen.
Agar merupakan agen gelling paling sering digunakan untuk menyiapkan media kultur jaringan tanaman semisolid dan solid. Agar memiliki beberapa keunggulan dibandingkan agen gelling lainnya. Pertama, ketika agar dicampur dengan air, membentuk gel yang meleleh pada sekitar 60 ° -100 ° C dan didinginkan pada sekitar 45 ° C, dengan demikian, agar gel yang stabil pada suhu inkubasi semua layak. Selain itu, gel agar tidak bereaksi dengan konstituen media dan tidak dicerna oleh enzim tanaman. Ketegasan dari gel agar dikendalikan oleh konsentrasi dan merek agar-agar digunakan dalam medium kultur dan pH medium. Konsentrasi agar yang umum digunakan dalam media kultur sel tanaman berkisar antara 0,5 dan 1,0%; ini konsentrasi memberikan gel yang kuat pada pH khas dari media kultur sel tanaman.
Gelling agen lain sering digunakan untuk komersial serta tujuan penelitian adalah Gelrite. Produk ini adalah sintetik dan harus digunakan pada 1,25-2,5 g / liter, menghasilkan gel yang jelas yang membantu dalam mendeteksi kontaminasi.
Alternatif metode ini termasuk dukungan penggunaan plastik berlubang, jembatan filter kertas, sumbu kertas filter, busa poliuretan, dan wol polyester. Apakah eksplan tumbuh terbaik agar atau agen pendukung lainnya bervariasi dari satu jenis tanaman ke yang berikutnya.
Pertumbuhan Regulator
Empat kelas yang luas dari pengatur tumbuh yang penting dalam kultur jaringan tumbuhan; yang auxins, sitokinin, giberelin, dan asam absisat. Skoog dan Miller adalah yang pertama kali melaporkan bahwa ransum auksin sitokinin ditentukan jenis dan tingkat organogenesis pada kultur jaringan tanaman. Keduanya merupakan auksin dan sitokinin biasanya ditambahkan ke dalam media kultur untuk mendapatkan morfogenesis, meskipun rasio hormon yang diperlukan untuk induksi tunas akar dan tidak universal sama. variabilitas yang cukup ada di antara genera, spesies, dan bahkan kultivar dalam jenis dan jumlah auksin dan sitokinin yang diperlukan untuk induksi morfogenesis.
